Jusqu’à récemment, la recherche ne parvenait pas à observer l’œil dans son intégralité. Une étape aujourd’hui franchie, notamment grâce aux travaux de Marie Darche, ingénieure de recherche au sein de l’équipe du Pr Paques au Centre d’Investigation Clinique de l’Hôpital des 15-20. Elle revient sur le long processus qui a permis d’imager l’œil entier et d’en révéler toutes les structures en 3D.
Pendant des années, les microscopes ont buté sur l’œil humain et sa complexité. D’abord parce que leur principe repose sur la traversée d’un échantillon par la lumière. Or l’œil est constitué d’eau, de graisse qui dévient et dispersent la lumière et de pigments qui absorbent la lumière. Résultat : l’organe reste quasiment opaque aux microscopex traditionnels. La seule façon de l’étudier consiste alors à le découper en milliers de tranches d’une dizaine de micromètres chacune. Pour reconstituer un œil entier de cette manière, il faut juxtaposer près de 3 000 coupes. Un travail titanesque qui revient à l’examiner par le trou d’une serrure puisque les chercheurs ne disposent que d’images fragmentées en 2D, sans jamais accéder à une vision globale, en trois dimensions. Une limite qui complique fortement le dialogue entre médecins et biologistes.
En effet, alors que les premiers formulent des hypothèses à partir d’images cliniques (une tache, un reflet, une zone qui bouge), les seconds tentent de vérifier ces suppositions en multipliant les coupes sur des yeux de donneurs. Avec le risque constant de passer à côté de la structure visée :
« C’est comme chercher une aiguille dans une botte de foin, sans avoir la certitude que l’aiguille s’y trouve vraiment ! », souligne Marie Darche.
Une difficulté encore accrue par le fait qu’aucun œil ne se ressemble et que chaque pathologie évolue différemment d’un patient à l’autre.
En bref, cette approche revenait à modéliser une complexité infinie sur la base d’indices parcellaires, sans jamais restituer toute la diversité de l’organe.
La transparisation pour rendre l’œil plus lisible
La transparisation est venue changer la donne, même si l’idée de rendre un tissu transparent pour laisser passer la lumière remonte au début du XXᵉ siècle. L’organe est plongé dans une succession de bains chimiques qui dépigmentent, déshydratent et éliminent les graisses, tout en conservant les protéines fixées dans le formol. Il est ensuite immergé dans une huile minérale et devient transparent tant qu’il y reste.
Ce procédé avait déjà révolutionné l’étude du cerveau ou des embryons, en révélant des structures jusque-là invisibles mais l’œil humain demeurait un territoire inaccessible : trop pigmenté, trop complexe, trop contrasté, il était considéré comme « l’organe impossible ».
« Pendant longtemps, on nous a dit : vous pouvez tout faire… sauf l’œil, raconte Marie Darche. Et pour cause : c’est l’organe des extrêmes ! La sclère et la cornée comptent parmi les tissus les plus résistants du corps humain, après les os et les cartilages, tandis que la rétine figure parmi les plus fragiles. Résultat : les protocoles trop doux, laissaient l’œil opaque ; trop forts, ils le détruisaient de l’intérieur. »
Après plusieurs années de travail, Marie Darche a réussi à adapter pas à pas les protocoles à l’œil humain. Aujourd’hui, un œil peut être rendu transparent tout en conservant l’intégrité de ses structures internes. Grâce aux marquages fluorescents, les vaisseaux, les nerfs ou les différentes couches de la rétine peuvent donc maintenant être observés dans leur environnement naturel, en 3D. Théoriquement !
Car encore faut-il un instrument capable de l’imager dans son intégralité.
Le mesoSPIM, le microscope qui révolutionne l’imagerie
En effet, les microscopes classiques, dits confocaux, imposent des délais décourageants pour analyser un œil entier :
« Pour observer un millimètre cube de tissu, il faut près de 100 heures, soit plus de 60 000 heures pour étudier les 6 cm³ d’un œil. Inenvisageable ! », indique Marie Darche.
Les microscopes à feuillet de lumière présentent une alternative prometteuse. Là où le microscope confocal fonctionne point par point, avec un laser qui balaie l’échantillon micromètre par micromètre, celui du microscope à feuillet de lumière passe à travers une lentille qui le transforme en feuille de lumière. Deux feuilles arrivent de part et d’autre de l’échantillon, la caméra capture l’image du plan, puis l’appareil se déplace d’un micromètre et recommence jusqu’à reconstituer l’ensemble de l’organe. Problème :
« tous les microscopes à feuillet de lumière que j’ai essayés plafonnent à 2 centimètres de distance de travail (soit l’espace disponible entre la lentille de l’objectif et l’échantillon), se désole Marie Darche. Or, un œil humain en mesure environ 3 ! Donc, même lorsque je parvenais à l’insérer dans le portoir à échantillon, je n’avais aucune marge pour le déplacer et l’imager correctement. »
La chercheuse s’est tournée vers la Suisse et le WYSS Center de Genève, pour utiliser un mesoSPIM, microscope sur-mesure conçu pour accueillir de plus gros échantillons. Et c’est avec ce dernier qu’elle a pu, pour la première fois, obtenir des images 3D d’œil humain transparisé, en changeant radicalement d’échelle de vitesse :
« Avant, pour imager un millimètre cube de tissu, il fallait près de 100 heures. Sachant qu’un œil entier fait environ 6 cm³, soit 6 000 fois cette taille, cela représente plus de 60 000 heures de microscopie ! Aujourd’hui, grâce au mesoSPIM, on peut obtenir l’image complète d’un œil humain en une heure seulement », se réjouit-elle.
Après plusieurs années d’allers-retours en Suisse, un mesoSPIM a pu être assemblé directement aux 15-20 grâce à un legs de patient à la Fondation 15-20 pour la vision. Le montage a été réalisé par Elena Gofas de l’Institut de la Vision et Olivier Thouvenin de l’Institut Langevin. Les 15-20 deviennent ainsi le deuxième site en France à disposer d’un mesoSPIM, après Saclay. Cette installation s’est accompagnée du recrutement d’Ivana Gantar qui fera tourner l’appareil au quotidien tandis que Marie Darche coordonnera la plateforme.
Un champ de perspectives infini
Avec l’acquisition du mesoSPIM et la technique de la transparisation, les chercheurs des 15-20 disposent à présent d’un dispositif unique en France pour explorer l’œil humain en 3D. Les premiers résultats obtenus en Suisse sont spectaculaires : nerfs, vaisseaux, couches rétiniennes, tout peut être visualisé dans son environnement naturel, sans découpe, et partagé entre cliniciens et biologistes.
« L’avantage, c’est que tout l’œil est imagé : chacun peut venir y chercher ce qui l’intéresse, qu’il travaille sur la cornée, la rétine ou la choroïde. Un même échantillon peut donc servir à de nombreuses recherches », note Marie Darche.
Mais cette avancée ouvre aussi un champ vertigineux.
« À chaque fois qu’on regarde une nouvelle zone, on découvre quelque chose qui n’a jamais été montré, poursuit-elle. C’est formidable, mais cela veut dire qu’il faut refaire toute l’anatomie classique, constituer des banques pour chaque pathologie, multiplier les marqueurs… »
Les premiers travaux vont porter sur des yeux sains, afin de reconstruire une base de référence, ainsi que sur le nerf optique encore mal connu. Viendront ensuite les pathologies, en fonction des dons de patients et du soutien des associations : occlusions veineuses, DMLA, glaucome…
La plateforme a également vocation à s’ouvrir aux collaborations, aux partenariats avec des chercheurs extérieurs qui souhaitent tester des protocoles, et même à certains projets précliniques. Un lien étroit est par ailleurs maintenu avec le Wyss Center en Suisse, qui dispose de microscopes complémentaires à très haute résolution. « On peut imaginer par exemple d’imager l’œil entier ici, puis d’envoyer une zone précise à Genève pour la regarder dans le moindre détail », explique Marie Darche.
À terme, l’objectif est de bâtir une véritable banque de données accessible à la communauté scientifique.
« Ces yeux, une fois imagés, deviennent en quelque sorte immortels. Ils pourront être réutilisés pour répondre à des centaines de questions différentes, aujourd’hui ou dans dix ans », promet la chercheuse.